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资讯.高效毛细管电泳色谱仪与质谱仪的联用技术

时间:2022-09-24 来源网站:十堰化工机械网

高效毛细管电泳色谱仪与质谱仪的联用技术

高效毛细管电泳色谱仪(CE)是以毛细管为分离通道,以高压直流电场为驱动力,利用荷电粒子之间的淌度差异和分配系数差异进行分离,具有高效、分辨率高、重复性好、速度快和易于自动化等优点。质谱仪(MS)是通过对样品离子的质量和强度的测定进行定量和结构分析,具有灵敏度高和速度快等优点。CE与MS联用综合了两者的优点,是分析生物大分子的有力工具。一、仪器结构:在CE-MS联用中,毛细管区带电泳较为常用,其它如毛细管凝胶电泳、毛细管胶束电动色谱、毛细管等电聚焦电泳和毛细管等速电泳等应用较少。电子喷雾离子化(ESI)可用于检测多种高质量的带电分子,从CE分离出来的分子经过接口可直接进入MS,是MS首选的离子源。二、接口技术:CE-ESI-MS接口的目标是获得稳定的雾流和高效的离子化,是影响整个检测的关键因素之一。由于CE需要较高离子强度和挥发性低的缓冲液,而ESI需要较低盐浓度才能获得好的雾化和离子化。因此,接口技术必须优化,以尽可能提供好的电子接触,尽量减少对CE分离效率的影响。此外,每一种接口应选择相应的缓冲液。CE-ESI-MS接口有同轴液体鞘流接口、无鞘接口和液体连接接口三种类型。1、同轴液体鞘流接口:同轴液体鞘流接口是连接CE与ESI-MS较常见的接口。(1)结构:在CE毛细管末端外套一个同心不锈钢毛细管套,内充鞘液。在此不锈钢套外再套一个同心不锈钢套,内通鞘气。鞘液和CE缓冲液在毛细管的高端混合,同时被鞘气雾化。鞘液流量通常为每分钟数纳升至数微升,显著高于CE的流速。由于鞘液的稀释作用,使雾流稳定性得到改善。理想的鞘液缓冲液的盐浓度应在高分离(高盐浓度)和高雾化(低盐浓度)之间进行优化。由于鞘液在雾化过程中完整蒸发,鞘液的稀释作用并不显著降低检测灵敏度,但混合液体的体积应尽可能小,以避免谱带展宽。(2)特点:由于鞘液对CE流出物的稀释作用而降低检测灵敏度,鞘液的成分和浓度对CE分离均有影响。2、无鞘接口:(1)结构:将CE毛细管末端做成尖细状,以获得稳定的电子雾化。在CE毛细管末端外套一个同心毛细管套,内通鞘气。此接口的难点是不易同时保持CE和ESI的电路循环,为此,在毛细管末端粘上金丝或镀一层金,但金的粘着力差,易被机械的和电子的原因除去。(2)特点:接口性能差且寿命短。3、液体连接接口:(1)结构:将CE毛细管末端与一个直径为10~20m的槽垂直相连,槽内充有CE缓冲液。与毛细管末端相对的槽的另一端接上ESI。(2)特点:可通过任意调节槽内液体流速以改善ESI效果,而这通常是以谱带展宽和分离效能降低为代价取得的。此接口技术难度较大,现仅用于芯片CE与MS联用中。三、样品预浓缩方法:由于CE受进样量的限制,对一些含量较低的样品的检测灵敏度仍显不足。因此,在样品分离前应进行预浓缩。样品预浓缩方法有基于电泳原理的预浓缩和基于色谱原理的预浓缩。1、基于电泳原理的预浓缩:(1)堆积进样:1)原理:根据样品塞子与CE缓冲液的导电性差异来实现。若样品的导电性小于CE缓冲液,样品塞子上的电场强度高于缓冲液,样品塞子中离子的迁移速度大于缓冲液。若样品以夹心饼干方式进行CE电泳,则样品在缓冲液中聚焦浓缩。2)特点:可显著增加样品的输出信号,约达20倍。(2)场放大进样:1)原理:场放大进样又称电场聚焦进样,类似于样品堆积进样,也是根据样品与CE缓冲液的迁移速度差异来实现,差别是进样步骤和聚焦过程。场放大进样是在整个进样过程都施加电压,聚焦发生在用缓冲液瓶更换为样品瓶直到CE电泳开始的一段时间。即场放大进样是根据样品的迁移速度与电场强度成正比的特点,在CE电泳初期,使样品从高电场突然转入低电场,因减速而堆积在电场交界处,使区带变窄,浓度提高,而达到聚焦浓缩的目的。2)特点:可突破样品堆积进样70%毛细管体积的进样量限制,使样品浓缩约100倍,但有进样歧视现象。(3)等速电泳进样:等速电泳进样既是CE的一种电泳模式,又可作为预浓缩的一种方法。采用等速电泳进样进行样品预浓缩有耦合毛细管等速进样和瞬时毛细管等速进样两种模式。1)耦合毛细管等速进样:①原理:将两根毛细管相连接,一根用作等速电泳(ITP),另一根用作CE电泳。②特点:仅适用于水溶性样品且装置复杂,不常用。2)瞬时毛细管等速进样:①原理:用一根毛细管既作ITP电泳,又作CE电泳。第一步,将样品溶解在前导电解质(通常是氨溶液)中,以压力进样方式将样品导入CE毛细管中。然后将毛细管插入尾随电解质瓶(通常为醋酸)中,在毛细管两端施加约30kV电压,使前导电解质、样品和尾随电解质向阴极移动,由于淌度差异,样品被聚焦在前导电解质和和尾随电解质之间。第二步,用前导电解质作为背景电解质进行CE电泳。②特点:对蛋白质和多肽均可进行分析,极具发展前景。2、基于色谱原理的预浓缩:(1)固相萃取:1)原理:固相萃取常用C2、C8和C18作吸附剂,萃取床连接在转移毛细管和CE之间。样品通过转移毛细管进入萃取床,用电泳缓冲液冲洗样品,随后注入50~100nL有机修饰剂塞子使样品洗脱进入CE。有机修饰剂可引起样品堆积。2)特点:可显著降低检测下限,但会使分离度降低,谱带展宽,峰拖尾。(2)液液分配色谱:1)根据液液分配色谱和电泳进行浓缩:①步骤:第一步,将样品溶解在非极性溶剂(如乙酸乙酯)中,以电动进样方式将样品导入CE毛细管中。同时,由于液体对流作用,可避免大量乙酸乙酯进入毛细管中。第二步,将毛细管插入尾随电解质瓶中,在电场作用下开始聚焦。第三步,达到稳态后,将毛细管插入前导电解质瓶中进行CE电泳。②特点:此法浓缩能力高达1000倍,但蛋白质易变性,在非极性相中易沉淀。2)用一张浸有非极性溶剂(如十一碳烷)的聚丙烯膜将预浓缩室隔成两个部分:一部分是供相,作为样品进入相;另一部分是受相,作为富集相。两相均为水溶性。通过调节两相pH,使样品在供相中不带电荷,进入受相则带电荷,从而达到浓缩目的。(3)中空纤维液相微萃取:1)原理:利用中空纤维壁能选择性阻止一定分子量的物质通过的特性而达到浓缩目的。将中空纤维通过Teflon管与CE毛细管相连接,以电动方式进样,由于蛋白质不能透过中空纤维壁而聚集在毛细管入口端。浓缩完成后,关闭进样电场,接通分离电场进行CE电泳。2)特点:此法速度快,浓缩效率高,可除掉一些小分子物质(如盐类),对痕量蛋白质的检测十分有效。(4)亲和色谱:1)原理:将亲和色谱柱与CE毛细管相连接,以压力方式进样,然后根据样品性质,以小体积的有机溶剂或特殊缓冲液进行洗脱,进入CE。2)特点:此法进样量可达50L,浓缩高达100~500倍,可有效地降低检测下限。CE-MS联用大大拓宽了CE和MS的应用领域,但CE固有的缺陷并未克服。在DNA分离时,极高的电场强度容易使较长的DNA发生伸展改变呈棒状,而降低分离效果。现有的接口类型都有不同程度的缺陷,随着接口技术的不断改进、芯片CE与MS联用技术的完善和新浓缩技术(如分子印迹)的应用,CE-MS在蛋白质组学、化学药物研究和临床实验诊断等领域已显示了广阔的前景,正成为分析工作者的重要工具之一。

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